ازمون الیزا ELISA

پایه اساسی آزمون الایزا براساس واکنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یک آنتی‌بادی اختصاصی با یک آنتی‌ژن مشخص واکنش داده و سپس با استفاده از یک آنتی‌بادی اتصال یافته با یک آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول که یک مادة رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد طول موج رنگ بدست آمده که نشانگر حضور یک آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد.

بعنوان مثال در یکی از رایج‌ترین روشهای الایزا ( روش غیر مستقیم) که برای شناسایی حضور و یا عدم  حضور آنتی‌بادی برعلیه یک آنتی‌ژن موردنظر بکار می‌رود ابتدا یک آنتی‌ژن برروی سطح جامد پوشش داده  می‌شود سپس نمونة مجهول که حضور و یا عدم حضور آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌ژن درون آن مورد بررسی قرار می‌گیرد بر روی این سطح جامد پوشش داده شده با آنتی‌ژن, افزوده می‌شود. پس از آن آنتی‌بادی ثانویه یا درحقیقت آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌بادی اولیه که متصل به آنزیم نیز می‌باشد افزوده می‌شود و در نهایت سوبسترای آنزیم در اختیار آنزیم قرار داده می‌شود و پس از گذشت مدت زمان لازم واکنش آنزیمی خاتمه داده شده و رنگ بدست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت می‌شود.

 

-2-1  مراحل یک آزمون الایزا

مراحل انجام یک آزمون الایزا به‌صورت زیر می‌باشد:

1)    جذب یک آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی به سطوح جامد پلاستیکی که اصطلاحا پوشش‌دهی نامیده می‌شود.

2)     افزودن نمونه‌های مورد آزمایش

3)     انکوباسیون واکنشگرها برای دراختیاز قراردادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش

4)     جدا نمودن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو

5)     افزودن عوامل متصل شده با آنزیم

6)     انکوباسیون واکنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش

7)     جدا نمودن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو

8)     افزودن سوبسترای آنزیم جهت تشخیص واکنش دهنده‌ها

9)     انکوباسیون واکنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش

10) خاتمه دادن واکنش آنزیمی توسط متوقف کننده‌ها و قرائت دانسیتة نوری بدست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر

 

شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:

3-2-2  فاز جامد

امروزه بیشتر از پلیت‌های 96 خانه‌ای بعنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل کراید و انواع سخت و محکم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم ‌اکنون شرکت‌های معتبر و متعددی به‌ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند دربعضی از انواع این پلیت‌ها، کف چاهک‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.

 بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایشهای متعددی با موفقیت با هر کدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت که قطعا کدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای کاملا یکسان که تنها در نوع پلیت متفاوتند و بررسی نتایج تشخیص داد که برای کدام نوع از آنتی‌ژن، کدام پلیت بهتر است. بطور کلی پلیت‌هایی که انتهای چاهک‌های آنها تخت می‌باشد توصیه می‌شود.

3-2-3 پوشش‌دهی

این مرحله که یکی از مهمترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد عبارتست از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر  روی پلیت ,درون چاهک‌ های یک پلیت 96 خانه‌ای, که عمدتا براساس واکنش‌ های آبگریز مابین ماتریکس پلاستیکی و پروتئین می‌باشد. بنابراین هر پروتئین یک ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واکنش بستگی به  بار خالص پروتئین ندارد.

 بنابراین افزودن هیدروفوبیسیتة واکنش پروتئین – پلیت موجب بروز این نواحی هیدروفوب در پروتئین‌ها شده و واکنش مابین پلیت و پروتئین را مستحکم‌ تر می‌ نماید، این دناتوره نمودن جزیی  پروتئین‌ها توسط قراردادن پروتئین در معرض دترژنت‌های ملایم و مواد دارای pH پائین حاصل می‌شود که بعد از این مجاورت می‌توان با استفاده از یک روش دیالیز مناسب، بافر پوشش‌دهی را با این مواد دناتوره کننده تعویض نمود.

 عمل پوشش‌دهی به عوامل زیر بستگی دارد.

الف) مدت زمان پوشش‌دهی

ب) دما

ج) غلظت پروتئین‌هایی که باید پوشش داده شوند.

د)‌ نسبت سطح چاهک‌ها به حجم محلول پوشش دهی

هـ) ضریب انتشار مولکولهای پروتئینی درون محلول پوشش‌دهی درون چاهک‌ها

عوامل فوق یکپارچه بوده و جدای از یکدیگر نیستند. یکی از مهمترین موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئین برای اتصال مناسب به پلیت می‌باشد که از طریق تیتراسیون پروتئین بدست می‌آید.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl یک راهنمایی خوبی برای بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئین‌ها جهت اتصال خوب به پلیت می‌باشد البته این محدوده وابستگی به خلوص نسبی پروتئین موردنظر جهت پوشش‌دهی دارد بنابراین غلظت یک پروتئین جهت پوشش‌دهی وابسته به فعالیت آن پروتئین می‌باشد مشخص است که یک محلول پروتئینی که دارای مقدار کمی از پروتئین موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت برطبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول کم می‌باشد و ناخالصی‌های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را که باید پروتئین موردنظر ما در اختیار داشته باشد اشغال می‌نمایند که در نهایت منجر به یک اندازه‌گیری ضعیف می‌شود.

 با استفاده از چند تست الایزا که در آنها غلظت پروتئین موردنظر برای پوشش‌دهی متفاوت است می‌توان به یک غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دادن دست یافت. توجه به این مطلب مهم است که دانسیتة اتصال پروتئین به پلیت درنتیجة نهایی بسیار مهم است. اتصال با دانسیتة بالا حتی ممکن اسب برخلاف انتظار ما به نتایج ضعیف منجر شود چرا که این دانسیتة بالا می‌تواند از لحاظ قضایی اجازة نزدیک شدن پروتئین دوم (آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی) را به پروتئین پوشش داده شده ندهد. درحقیقت مولکولهای پروتئین پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحکام بالایی (و بینابین یکدیگر) به سطح چاهک متصل شده‌اند که حتی جایگاه‌های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضا آنتی‌بادی) نمی‌باشد.

 غلظت‌های بالای پروتئینی که باید پوشش داده شود نیز منجر به‌همین مسئله می‌شود.  رابطه غلظت یک آنتی‌ژن یا  آنتی‌بادی با چگالی نوری (OD) بدست آمده در مرحلة نهایی تست الایزا یک رابطة خطی صرف نمی‌باشد و برای هر پروتئینی بسته به فرم فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده‌ای از غلظت‌های مختلف آن پروتئین متفاوت می‌باشد.

 

میزان هیدروفوبیسیتة واکنش پروتئین – پلیت وابسته به دما نیز می‌باشد افزایش دما موجب افزایش این  هیدروفوبیسته می‌شود  و دانستیم که این افزایش منجر به اتصال مستحکم‌ تر پروتئین به پلیت می‌ شود یکی از   رایج‌ترین روش‌های پوشش‌دهی از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پلیت با پروتئین در دمای 37°c می‌ باشد  که در این دما بین 1 تا 3 ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین‌  ها می‌باشد در مرتبة بعد می‌توان روش  پوشش‌دهی در طول شب در 4°c و یا ترکیبی از ایندو را بکار گرفت.

بسته به ماهیت پروتئین‌ها، گاهی اوقات پوشش‌دهی در دمای آزمایشگاه با مدت زمان طولانی‌تر موردنظر قرار می‌گیرد.

البته مشخص است که افزایش دما در مدت زمان طولانی ممکن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین موردنظر جهت اتصال به پلیت شود. تکان دادن یکنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می‌تواند با افزایش میزان برخورد و درنتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان موردنظر برای پوشش‌دهی را کاهش دهد.

3-2-3-1  بافر پوشش‌دهی

بیشترین بافرهایی که هم‌اکنون مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

  • بافر کربنات 6/9 = pH با کربنات 50  میلی مولار،

  •  Tris – Hcl   بیست میلی مولار با pH = 8/5 و یا

  •  PBS   10 میلی مولار با pH = 7/2

 اغلب روش‌های الایزا از یکی از این سه نوع بافر استفاده می‌نمایند.

 بافرهایی غیر از موارد فوق هنگامی مورد استفاده قرار می‌گیرند که مشکلی در پوشش‌دهی با بافرهای فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوری بهترین بافری که مورد  استفاده قرار می‌ گیرد بافری است که دارای pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئین اتصالی باشد. اما درعمل اندازه‌گیری این مطلب آسان نمی‌باشد چراکه پروتئین اتصالی (فرضا آنتی‌ژن) حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت می‌باشد. با انجام چند آزمایش الایزا که pH‌های متفاوت و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش‌دهی داشته باشد می‌توانیم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئین به پلیت را بدست آوریم.

پروتئین‌ های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یک pH پائین‌ تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه مابین پروتئین و پلیت دارند و در آزمایشی جهت پوشش دادن پروتئین‌ های ویروس Herpes simplex که خاصیت اسیدی دارند بهترین pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

در روش‌ های رایج امروزی پوشش دادن با بافر PBS یا کربنات اغلب موفقیت‌آمیز است.

گاهی اوقات بعضی از آنتی‌ژن‌ها مشکلاتی را در پوشش‌دهی بوجود می‌آورند این آنتی‌ژن‌ها شامل پلی‌ساکاریدها لیپوپلی‌ساکاریدها و گلیکولیپیدها هستند که پوشش‌دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می‌نمایند در اینگونه موارد یک پوشش‌دهی ابتدایی موردنیاز است که با یک آنتی‌سرم اختصاصی انجام می‌شود که یک حالت ساندویچی را بوجود می‌آورد که در ادامة همین فصل توضیح داده خواهد شد.

بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی‌ژن‌ها مناسب برای پوشش‌دهی مستقیم نمی‌باشد و درصورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده می‌شود.

بدلیل ماهیت غیر کووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جداشدن یک پروتئین از پلیت نیز ممکن است رخ دهد اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد این مطلب تأثیر مهمی در یک آزمون الایزا نخواهد گذاشت.