مقدمه ای بر سرولوژی:

مقدمه ای بر سرولوژی:

سرولوژی علم مطالعه سرم ها است، از دید اختصاصی تر، سرولوژی شامل مطالعه واکنش های آنتی ژن_ و آنتی بادی در خارج از بدن است (Invitro)

مصونیت روشهایی است که توسط آنها ارگانیسم زنده از خود در مقابل عفونت دفاع می کند. ایمونولوژی علم مطالعه تولید آنتی بادی بر علیه آنتی ژنهای بیگانه در بدن است (In vivo).

لغت مصونیت یا Immunity  به معنی مقاومت نسبت به عوامل مولد عفونت، ذرات بیگانه، توکسین ها سلولهای زنده و سرطان می باشد.

1- اساس و پایه آزمایشات سرولوژی:

آزمایشات سرولوژی بالینی یکی از روشهای سریع و اسان در تشخیص بیماریها می باشد این آزمایشات بر اساس اتصال آنتی بادیهای اختصاصی (Specific antibody) به آنتی ژن مربوطه صورت می گیرد. آنتی ژن مورد نظر می تواند باکتری، ویروس، گلبول قرمز، پروتئین، هورمون یا چیزی یا چیزی دیگر باشد.

اتصال آنتی ژن به آنتی بادی یک واکنش اختصاصی، دو طرفه و برگشت پذیر می باشد و از قوانین تئوری عکس العمل بین اسیدهای ضعیف و بازهای پیروی می کند.

  • آنچه که باید در رابطه با آزمایشات سرولوژیک بدانیم:

1-1-        عواملی که بر واکنشهای آنتی ژن و آنتی بادی دخالت می کنند.

1-2-        انواع واکنشهای سرولوژیک

1-1- عواملی که بر واکنشهای آنتی ژن و آنتی بادی دخالت می کنند:

a- affinity  یا قدرت اتصال آنتی بادی به آنتی ژن:

a2- Avidity: قدرت اتصال آنتی بادی به آنتیژنهای پلی والان را آویدیتی می گویند

b- PH محیط:

c- قدرت یونی محیط (ionic strength):

d_ زمان:

E_ درجه حرارت:

F_ تأثیر حرکت دادن:

H_ نسبت غلظت آنتی ژن و آنتی بادی:

G_ تأثیر مواد احیاء کننده:

2-1- انواع واکنشهای سرولوژیک:

طبقه بندی واکنشهای سرولوژیک بر اساس شکل مولکولی آنتی ژن یا کار آنتی بادی و آنتی ژن انجام می گیرد.

انواع واکنشهای سرولوژیک بر اساس شکل مولکول آنتی ژن:

a_ واکنشهای متراکم یا آگلوتیناسیون (Agglutination):

b- واکنشهای رسوبی یا پرسیپیتاسیون (Precipitation):

c- واکنشهای فلوکولاسیون (Fluccolation):

4-2-1: انواع واکنشهای سرولوژیک بر اساس کار آنتی بادی و آنتی ژن:

1: واکنشهای آگلوتیناسیون

2: واکنشهای پرسیپیتاسیون

3: واکنشهای نوترالیزاسیون

4: واکنشهای فیکساسیون کمپلمان یا ثبوت مکمل

5: واکنشهای ایمونوالکتروفورز

 

6: واکنشهای نشاندار با مواد فلوئورسان: (IF)

7: واکنشهای نشاندار با آنزیم (Enzyme Immuno assay) (EIA)

8: واکنشهای نشاندار با مواد رادیو اکتیو (RIA)

9: واکنشهای کمی لومینسانس

آگلوتیناسیون غیر فعال:

اگر در آزمایش آگلوتیناسیون، آنتی بادی ناقص یا مسدود کننده باشند بعبارتی وقتی از چندین ظرفیت آنتی بادی فقط یک ظرفیت ان به آنتی ژن ذره ای متصل شود کمپلکس (ab، ag) ایجاد می شود و شبکه کمپلکس آنتی ژن و آنتی بادی تشکیل نمی گردد فلذا آگلوتیناسیون با چشم دیده نمی شود به این نوع واکنش می گوییم آگلوتیناسیون غیر فعال.

برای تولید شبکه کمپلکس آنتی ژن و آنتی بادی از معرف کومبس (آنتی گاماگلوبولین انسانی) استفاده می کنند که باعث تشکیل شبکه ای از آنتی ژنها و آنتی بادی گشته و آگلوتیناسیون قابل رویت می گردد معمولاً در این موارد کلمه کومبس به اول نام آزمایش اضافه می کنیم مثلاً تست کومبس رایت (coombs wright)

آگلوتیناسیون پاسیو:

گفتیم وقتی آنتی ژنها محلول باشند نمی توانند آگلوتیناسیون ایجاد کنند فلذا برای ایجاد آگلوتیناسیون، آنتی ژنهای محلول را روی ذرات لاتکس (ذراتی مثل پلی استرن و در قطرهای 8/0 میکرون و سایزهای دیگر) سوار می کنند و آنتی ژنهایی بدست می آید که شبیه آنتی ژنهای ذره ای بوده و در واکنش با آنتی بادیهای اختصاصی تولید آگلوتیناسیون می کنند که با چشم دیده می شود به این آگلوتیناسیون، آگلوتیناسیون پاسیو یا لاتکس آگلوتیناسیون می گوییم مثل تست CRP_ تست RF_ تست گراویندکس

هماگلوتیناسیون:

اگر آنتی ژن ذره ای خود گلبول قرمز (Heme) باشد. آگلوتیناسیون حاصله را هماگلوتیناسیون می گویند. مثل تعیین گروههای خونی، مثل تست هماگلوتیناسیون برای منونوکلئوز عفونی _ تست هماگلوتیناسیون برای کیست هیداتیک

طرز تهیه سوسپانسیون 5-3% گلبول قرمز

برای اینکار ابتدا چند سی سی خون کامل (مثلاً 2-1 سی سی ) را در داخل یک لوله آزمایش ریخته و لوله را پر از سرم فیزیولوژی می کنیم و آنرا به آرامی مخلوط می کنیم.

مرحله شستشو:

1- لوله را در داخل سانتریفوژ با دور 3000 بمدت 5-3 دقیقه سانترفیوژ می کنیم

     2- لوله را از سانترفیوژ برداشته با سر و ته کردن آرام لوله مایع سفید رویی را دور می ریزیم.

3- کمی سرم فیزیولوژی به لوله اضافه کرده، آنرا آرام مخلوط کرده و سپس لوله را با سرم فیزیولوژی پر می کنیم.

4- مجدداً سانتریفوژ می کنیم و از مرحله دوم به بعد را 4-3 بار تکرار می کنیم.

5- در مرحله آخر مایع رویی را دور ریخته و گلبولهای قرمز رسوب شده را به آرامی به هم می زنیم.

مرحله تهیه سوسپانسیون 5%: 5/0 سی سی از RBC شسته شده را برداشته و در داخل یک لوله بزرگ ی بشر کوچک می ریزیم و سپس روی آن 5/9 سی سی سرم فیزیولوژی اضافه می کنیم. (5/0 = 5%)

اگر خون شسته شده زیاد باشد می توان حجم بیشتر از سوسپانسیون را تهیه کرده مثل 95cc- RBC5cc سرم فیزیولوژی.

تعیین گروه خونی سیستم ABO:

الف_ روش مستقیم (Cell Type)

ب_ روش غیر مستقیم یا معکوس (Back Typing or Revers):

الف_ روش مستقیم تعیین گروه خونی:

-       یک صفحه شیشه ای (لام) یا کاشی سفید انتخاب کرده و از خون کامل یا سوسپانسیون گلبول قرمز 50% دو قطره مجزا روی کاشی یا لام قرار می دهیم.

-       از آنتی سرم A (ویال آبی رنگ) یک قطره روی قطره خون سمت چپ اضافه می کنیم و از آنتی سرم B (ویال زرد رنگ) یک قطره روی قطره خون سمت راست اضافه می کنیم.

-       با آپلیکاتور پلاستیکی آنرا به هم می زنیم و بعد از 2-1 دقیقه هماگلوتیناسیون را بررسی می کنیم نتایج واکنش هماگلوتیناسیون و تعیین گروه خونی در جدول زیر نمایش داده شده است.

هماگلوتیناسیون با Anti-B

هماگلوتیناسیون با Anti-A

 

-

+

گروه خونی A

+

-

گروه خونی B

+

+

گروه خونی AB

-

-

گروه خونی O

 

ب- تعیین گروه خونی بروش معکوس (Revers typing):

در این روش از سرم (بجای خون) برای تعیین آنتی بادی گروههای خونی استفاده می کنیم سپس از روی نوع از روی نوع آنتی بادی شناسایی شده نوع آنتی ژن را تشخیص می دهیم. (نوع گروه خونی).

- ابتدا سوسپانسیون های 50% گروه خونی B و A را بطور جداگانه تهیه می کنیم.

- یک لام شیشه ای یا کاشی سفید را انتخاب کرده و دو قطره سرم فرد را بطور جداگانه روی لام قرار می دهیم.

- سپس از روی سوسپانسیون گلبول قرمز 50% A یک قطره روی سرم چپ اضافه می کنیم و یک قطره از سوسپانسیون 50% B را به سمت راست اضافه می کنیم.

- با آبیلیکاتور پلاستیکی آنرا به هم می زنیم و بعد از 2-1 دقیقه نتایج هماگلوتیناسیون را بررسی می کنیم..

- نتایج واکنش هما گلوتیناسیون و تعیین گوه خونی غیر مستقیم در جدول زیر نمایش داده شده است.

نوع آنتی بادی در سرم

هماگلوتیناسیون با سوسپانسیون B

هماگلوتیناسیون با سوسپانسیون A

 

Anti-B

+

-

گروه خونی A

Anti – A

-

+

گروه خونی B

-

-

-

گروه خونی AB

Anti-AB

+

+

گروه خونی O

 

روش تعیین Rh در لوله و آزمایش تکمیلی کومبس:

1- در یک لوله آزمایش 12×75 یک قطره سوسپانسیون 50% RBC می ریزیم (یا خون کامل)

2- یک قطره آنتی سرم D اضافه می کنیم و بعد از 2 دقیقه آگلوتیناسیون را بررسی می کنیم اگر مشکوک بودیم و یا آگلوتیناسیون ضعیف باشد مرحله بعد را انجام می دهیم.

3- دو قطره آنتی هیومین گلوبولین (معرف کومبس) اضافه می کنیم.

4- 3-4 دقیقه در حرارت اطاق و یا 37  انکوبه کرد.

5- با دور 1000 بمدت یک دقیقه سانتریفوژ می کنیم.

و سپس با انگشت دست به آرامی به ته لوله ضربه ملایممی زنیم و نتیجه آگلوتیناسیون را بررسی می کنیم.

آزمایش کومبس مستقیم:

هدف:

تعیین D-Anti هایی است که توسط مادر تولید شده و روی RBC جنین اتصال یافته اند. بنابراین نمونه لازم همان خون بند ناف (یا گلبولهای قرمز نوزاد) خواهد بود و این آزمایش هنگام تولد از نوزاد انجام می گیرد تا به موقع تعویض خون انجام شود.

آزمایش کومبس غیر مستقیم:

هدف:

تعیین آنتی کرهای D از سرم مادر است این آزمایش از سرم مادر در زمان قبل از حاملگی یا مراحل اول حاملگی انجام می گیرد تا مشخص شود آیا مادر در زایمان اول حساس شده یا نه.

 آزمایش کومبس غیر مستقیم:

a- مرحله حساس کردن گلبول قرمز: ابتدا از گلبولهای قرمز گروه خونی O و  سوسپانسیون 5% تهیه می کنیم.

1- در یک لوله آزمایش 12100 مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون فوق را میریزیم.

2- مقدار 100 میکرولیتر سرم بیمار (مادر حامله) را اضافه می کنیم.

3- بمدت 30 دقیقه در بن ماری 37 درجه سانتیگراد انکوبه میکنیم.

b- مرحله شستشو و کومبس:

4- گلبولهای قرمز حساس شده فوق را 3 بار با سرم فیزیولوژی می شوییم.

5- پس از آخرین سانتریفوژ، لوله آزمایش را برگردانده و تمام سرم فیزیولوژی را خارج کرده و آخرین قطره را با دستمال کاغذی پاک می کنیم.

6- دو قطره معرف کومبس (آنتی هیومن- گلوبولین) را به لوله فوق اضافه می کنیم.

7- 3 دقیقه در حرارت 37 درجه سانتیگراد قرار می دهیم.

8- یک دقیقه در دور 1000 سانتریفوژ می کنیم.

تفسیر: نتیجه ازمایش را با ضربه ملایم به ته لوله بررسی می کنیم. آگلوتیناسیون مثبت دلالت بر حساس بودن سیستم ایمنی بدن بیمار بر علیه آنتی ژن مذکور می باشد.

در آزمایش کومبس مستقیم از خون بند ناف یا خون نوزاد بعد از تولد استفاده کرده و از مرحله 4 به بعد را انجام می دهیم.

کاربرد آزمایش کومبس غیر مستقیم:

1- مادران Rh منفی که احتمالاً بر علیه ژنD حساس شده اند.

2- آزمایش کراس مچ

3- تشخیص آنتی ژن (تست تکمیلی Rh و کومبس)

4- تشخیص گروههای خونی kellو Duffy و kidd

5- تشخیص آنتی بادیهای ناقص یا مسدود کننده.

آزمایش رایت: Wright Test:

برای تشخیص بیماری بروسلوزیس که بنامهای دیگر نظیر تب مالت، تب مواج نیز مشهور است بکار می رود عامل بیماری شامل باکتری زیر می باشد:

1- بروسلا آبور توس B.abortus عامل بیماری در گاو

2- بروسلا ملی تنسیس B.Melitensis عامل بیماری در گوسفند و بز

3- بروسلا کانیس B. canis عامل بیماری در سگ

4- بروسلا سوئیس B. suis عامل بیماری در خوک

روشهای تشخیص سرولوژیکی بروسلوز:

1- تهیه سرم:

از بیمار خون گرفته و سرم آن را جدا نمایید. چنانچه در روز تهیه سرم، نمونه مورد آزمایش قرار نگیرد، لازم است که تا روز آزمایش سرمها را در حرارت 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری نمود.

2- تست سریع یا آنگلوتیناسیون اسلایدی:

طبق جدول ذیل مقادیر مختلف سرم مورد آزمایش و آنتی ژن بروسلایی را در حفرات یا دوایر اسلاید شیشه ای مخصوص به وسیله پیپتهای سرولوژی اضافه نمائید. پس از اضافه کردن آنتی ژن، با آپلیکاتور از رقت پایین به رقت بالا محتوات آن را مخلوط می کنیم و بمدت 5 دقیقه در روی روتاتور حرکت دورانی می دهیم.

روش راپید:

شماره حفرات اسلاید        1   2    3    4    5

سرم بیمار به میلی لیتر 08/0 04/0 02/0 01/0 005/0

مقدار آنتی ژن بروسلایی یک قطره یک قطره یک قطره یک قطره یک قطره

رقت سرم                 20  40   80   160   320

حدود تیتر آنتی بادی     20/1  40/1  80/1  160/1  320/1

 

3- تست استاندارد لوله ای:

طبق جدول مقابل مقادیر مختلف سرم فیزیولوژی، سرم بیمار و آنتی ژن را که همان آنتی ژن مورد مصرف در روش اسلایدی است با این اختلاف که قبلاً با سرم فیزیولوژی 20 بار رقیق شده است را به ده لوله همولیز تمیز (میلیمتر 10013) به ترتیب زیر اضافه نمایید:

سپس محتویات لوله ها را مخلوط نموده و با جا لوله ای به مدت 48 ساعت در حرارت 37 درجه سانتیگراد قرار دهید و سپس با ضربه مختصری به انتهای لوله آزمایش آگلوتیناسیون را در ته لوله ها مشاهده کنید. آخرین لوله ای که آگلوتیناسیون داده باشد تیتر آنتی بادی را مشخص می کند. مثلا اگر آخرین لوله که در آن آگلوتیناسیون مشاهده شده است لوله شماره 6 باشد، تیتر آنتی بادی در سرم مورد آزمایش برابر 640/1 خواهد بود. یکی از طریق مطالعه آگلوتیناسیون برای صرفه جوئی در وقت، سانتریفوژ سریع لوله ها در 3000rpm به مدت یک دقیقه و مطالعه آگلوتیناسیون می باشد.

 جدول رایت لوله ای:

شماره لوله             1   2  3   4   5   6   7   8   9   10

سرم فیزیولوژی به ml   9/0 5/0 5/0  5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0

سرم بیمار ml         1/0  5/0 5/0  5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0

ابتدا به لوله شماره یک 0/1ml سرم بیمار را افزوده و محتویات را مخلوط نموده و 0/5ml برداشته و به لوله دوم منتقل کنید و این عمل را تا لوله شماره 9 ادامه دهید. سپس از لوله شماره 9، 0/5ml برداشته و دور بریزید و لوله دهم لوله کنترل آنتی ژن است.

آنتی ژن رقیق ml        5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 

                           محتویات کل لوله ها برابر 1ml  است

رقت نهایی سرم            20  40  80  160 320 640 1280 2560 5120

تیتر سرم                20/1 40/1 80/1 160/1 320/1 640/1 1280/1 2560/1 5120/1

 

4- روش انجام آزمایش کومبس:

این آزمایش برای تشخیص آنتی بادیهای ناقص (Incomplete) یا مسدود کننده (Blocking)، خصوصاً در موارد رجعت بروسلوز یا مرحله مزمن می باشد.

1- ابتدا آزمایش رایت لوله ای را مطابق دستوری که گفته شده بطور کامل انجام داده و نتایج را یادداشت نمائید.

2- سپس لوله ها را به مدت 10 دقیقه در دور 3000 در دقیقه سانتریفیوژ و رسوب آنها را جدا و سه بار با سرم فیزیولوژی بشوئید.

3- پس از آخرین سانتریفیوژ، سرم فیزیولوژی بالای رسوب را دور ریخته و آخرین قطره آنرا روی دستمال کاغذی خارج نمایند. سپس به ته هر لوله یک قطره سرم آنتی گلبولین انسانی (سرم کومبس) اضافه کرده و لوله ها را تکان دهید.

4- لوله ها را نیم ساعت یا یکساعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار دهید.

5- لوله ها را به مدت 10 دقیقه در دور 3000 در دقیقه سانتریفیوز نمائید.

6- نتیجه را با زدن ضربه آرامی به ته لوله ها بررسی و تیتر آخرین لوله ای که آگلوتیناسیون مشاهده گردید، گزارش نمائید.

5- روش انجام آزمایش رزبنگال:

آزمایش رزبنگال در منابع مختلف به اسامی رزبنگال پلیت تست، کاردتست ( Card test)، آزمون سریع یا راپید ( test) و غیره نامیده می شود. آنتی ژن رزبنگال به رنگ قرمز متمایل به صورتی و با PH اسیدی برابر با 05/0  6/3 و به جرم نهائی 8 درصد، از کلنی های صاف (smooth) بروسلا آبورتوس سویه 99 یا 19 که فاکتورهای آنتی ژنی مشترکی با دیگر سویه های بروسلا دارند، طبق روش استاندارد بین المللی در موسسه رازی. این آنتی ژن جهت تشخیص اولیه در برنامه های کنترل و ریشه کنی بروسلوز بکار می رود. آنتی ژن رزبنگال را باید دور از نور و در یخچال چهار درجه سانتی گراد نگهداری کرد و تا زمانی که اتو آگلوتینه نشده، قابل مصرف است. قبل از انجام آزمایش باید ابتدا آنتی ژن رزبنگال و سرم بیمار را از یخچال خارج کرده و در محیط آزمایشگاه به مدت 20 تا 30 دقیقه نگهداری نموده تا به دمای آزمایشگاه برسند. سپس روی یک صفحه شیشه ای یا سفید یک قطره معادل 03/0 میلی لیتر سرم را مجاور یک قطره آنتی ژن قرار داده و با یک میله نازک چوبی یا پلاستیکی، این دو قطره را با هم مخلوط و به اندازه دایره ای به قطر حدود 5/2 سانتی متر پخش نمائید. سپس صفحه را در دست یا روی روتاتور بمدت حداکثر چهار دقیقه حرکت داده و نتیجه آگلوتیناسیون را در زیر نور چراغ قرائت نمائید. واکنش مثبت به حالتی گفته می شود که دانه های آگلوتینه بطور مشخص جدا از هم دیده شوند و در موارد منفی، دو قطره مخلوط شده به حالت یکنواختی باقی خواهند ماند. در آزمایش رزبنگال موارد مشکوک دیده نمی شود و نتیجه با قاطعیت مثبت یا منفی می باشد.

تبصره 1: آ«تی ژن رزبنگال موسسه رازی را نباید رقیق کرد. در صورت رقیق کردن، خصوصیات آنتی ژن مانند تعداد ذرات میکروبی، PH و الکترولیتهای آن تغییر می کند و جوابهای مثبت یا منفی کاذب که با وضعیت بالینی هماهنگی ندارند، ایجاد می شود.

تبصره 2: آنتی ژن رزبنگال را نباید برای روش لوله ها استفاده کرد.

تبصره 3: آنتی ژن رزبنگال، نباید یخ بزند.

روش انجام آزمایش کومبس – رایت

این آزمایش برای تشخیص آ«تی بادیهای ناقص (Incomplete) یا مسدود کننده (Blocking)، خصوصاً در موارد رجعت بروسلوز یا مرحله مزمن می باشد.

1- ابتدا آزمایش رایت معمولی در لوله را مطابق دستوری که گفته شده بطور کامل انجام داده و نتایج را یادداشت نمائید.

2- سپس لوله ها را به مدت 15 دقیقه در دور 2000 در دقیقه سانتریفیوژ و رسوب آنها را جدا و سه بار با سرم فیزیولوژی بشوئید.

3- پس از آخرین سانتریفیوژ، سرم فیزیولوژی بالای رسوب را دور ریخته و آخرین قطره آنرا روی دستمال کاغذی خارج نمایند. سپس به ته نشین هر لوله یک قطره سرم آنتی گلبولین انسانس Polyspecific (سرم کومبس) اضافه کرده و لوله ها را تکان دهید.

4- لوله ها را نیم تا یکساعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار دهید.

5- لوله ها را بمدت 15 دقیقه در دور 2000 در دقیقه سانتریفیوژ نمائید.

6- نتیجه را با زدن ضربه آرامی به ته لوله ها بررسی و تیتر آخرین لوله ای که آگلوتیناسیون مشاهده گردید، گزارش نمائید.

روش انجام آزمایش رایت سانتریفیوژ:

روش رایت سانتریفیوژ توسط دکتر نظری و همکاران در بخش ایمونولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران پیشنهاد شده است. برای انجام این آزمایش، سرم را طبق روش معمولی رایت در لوله ها رقیق کرده و به آنها آنتی ژن بروسلا را اضافه می کنند و بلافاصله با سرعت 2500 دور در دقیقه بمدت ده دقیقه سانتریفیوژ کرده و جوابها یادداشت می شوند. با این روش اکثراً پدیده منطقه ای نیز از بین می رود.

آزمایش 2ME-Wright Test:

این آزمایش پس از مثبت شدن آزمایش رایت انجام می شود تا کلاس آنتی بادی را تشخیص داد. با این آزمایش، مولکولهای IgM سرم از بین می روند ولی IgGو IgA نسبت به مواد احیا کننده در غلظتی که استفاده می شود، مقاوم است. مواد احیا کننده، پیوندهای دو سولفیدی (-S-S-) را بصورت SH، بین زنجیره های سنگین و سبک ایمونو گلبولین باز می کند. مهمترین کاربرد این آزمایش، تشخیص افتراقی بین بروسلوز فعال از غیر فعال در فردی که تظاهرات بالینی بیماری را ظاهراً دارد ولی کشت خون یا سایز نمونه ها، عاری از میکروب بروسلا و تیتر آزمایش رایت او نیز پائین است. بعلاوه با انجام این آزمایش می توان تأثیرر آنتی بیوتیک مناسب را در درمان بیماری تحت بررسی قرار داد.

 محلولهای مورد لزوم:

1- تامپون یا بافر فسفات نمکی PBS=7.2 محتوی 1/0 مولار 2- مرکاپتواتانول ( محتوی 1/0 مولار 2- مرکاپتواتانول (2-ME)یا بافر فسفات نمکی محتوی 005/0 مولار 1 و 4- دی تیوترئیتول (DTT). از آنجایی که 2-ME بوی زننده ای دارد و باید در زیر هواکش یا هود  (Hood) کار کرد، بنابراین اگر در آزمایشگاهی هود موجود نیست می توان از DTT استفاده کرد. بهتر است است تامپون 2- مرکاپتواتانل در روز آزمایش آماده شود و درب آن محکم بسته شده تا تبخیر و غیر فعال نگردد.

2- آنتی ژن بروسلا، سرم و سایر محلولهائی که برای این آزمایش بکار می روند باید فاقد فنل باشند، زیرا که فنل از کار مواد احیاء کننده (2-مرکاپتواتانل و دی تیوئیتول) جلوگیری می کند. در صورتی که آنتی ژن محتوی فنل باشد باید قبل از آزمایش چند بار آنرا با بافر فسفات نمکی شستشو داد.

روش کار:

1- تعداد 10 از لوله آزمایش سرولوژی را در جا لوله ای ممناسب قرار دهید. (جدول شماره 3-6).

2- مقدار 9/00 سانتی متر مکعب بافر فسفات نمکی محتوی ماده احیا کننده را در لوله آزمایش اول بریزید.

3- مقدار 1/0 سانتی متر مکعب سرم بیمار را به لوله اول آزمایش اضافه نموده و سر لوله را با کاغذ پارافیلم مسدود نمائید.

4- لوله اول را بمدت یکساعت در درجه حرارت اطاق یا 37 درجه سانتی گراد قرار داده و مواد احیا کننده اثر خود را نموده و باعث تجزیه و غیر فعال شدن IgM گردد.

 پدیده منطقه ای یا پره زون:

در صورتی که غلظت آنتی بادی بیشتر از آنتی ژن باشد واکنش انجام نمی گیرد و احتمال جواب کاذب در لوله های اول وجود دارد که در تست رایت دیده می شود.

ب- روش اگلوتیناسیون سریع: Rapid Plate Agglutination Test

روی شیشه پاک و تمیزی بکمک خط کش و مداد شمعی حدود 64 مربع به ابعاد 5/1*5/1 سانتی متر می کشیم سپس با استفاده از پی پت 1/0 میلی لیتر و یا سمپلر (Sampler) مقادیر 08/0، 04/0، 02/0، 01/0، 005/0، 002/0 میلی لیتر از سرم خون بیمار را در شش خانه افقی ریخته و یک قطره از آنتی ژن مورد نظر را به آنها اضافه می نمائیم.

مخلوط آنتی ژن و سرم را توسط اپلیکا تور چوبی بخوبی بهم می زنیم. شاهد نیز یک قطره آنتی ژن در خانه هفتم است شیشه را چندین بار تکان داده و نتیجه آزمایش را بعد از یک دقیقه به شرح ذیل ثبت می نمائیم.

100% اگلوتیناسیون با علامت (++++)، 75% اگلوتیناسیون با علامت (+++)، 50% اگلوتیناسیون باعلامت (++)، 25% اگلوتیناسیون با علامت (+) و بالاخره اگلوتیناسیون منفی با علامت (-) مشخص می شود. (تابلوی شماره 2).

لازم به یادآوری است که در روش اگلوتیناسیون سریع چند نکته زیر را باید مد نظر داشت.

1- تیتراژ برابر است با عکس بالاترین رقتی که با مقایسه شاهد حداقل 50% (++) اگلوتیناسیون از خود نشان دهد.

2- بعد از اضافه نمودن آنتی ژن مقادیر 08/0 تا 02/0 میلی لیتر از سرم خون به ترتیب معادل  ، ،،،، رقت خواهد شد.

3- در این روش باید به محدودیت زمانی توجه خاصی نمودوضمن آزمایش نبایدشیشه الگوتیناسیون را نزدیک حرارت قرار دادکه هر دوصورت مقداری آب تبخیرگشته و نتیجه ای صحیح حاصل نمیگردد.

تابلو( 2)نمونه ثبت نتیجه در روش اگلوتیناسیون سریع

 

 

مقدارسرم

(ml)

رقت مشابه

شدت اگلوتیناسیون نمونه اول

نمونه دوم

نمونه سوم

8%

1:20

***

***

****

4%

1:40

**

****

***

2%

1:80

*

***

**

1%

1:160

-

**

*

/ 0 نظر / 53 بازدید